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VIROLOGIE

À sa naissance en tant que discipline particulière, la virologie (étude des virus) recouvrait un domaine très large et mal défini. Le terme même de virus désignait, en effet, un principe infectant, générateur de maladies qui étaient loin d’être toutes provoquées par ces organismes réunis aujourd’hui dans une catégorie beaucoup mieux délimitée. Les observations de Jenner puis les travaux de Pasteur ont marqué une première étape au cours de laquelle la virologie est devenue une science qui se différencie peu à peu de la bactériologie. Pendant cette période, les méthodes d’étude des virus sont demeurées dépendantes de l’animal entier qui devait être utilisé pour la symptomatologie des infections virales comme pour la multiplication de leurs agents. On peut considérer qu’une deuxième étape a été franchie avec les cultures cellulaires dont l’emploi s’est considérablement développé depuis les travaux de J. F. Enders (1949) sur le virus de la poliomyélite. Cette méthode a été à l’origine d’immenses progrès réalisés par la virologie, en ce qu’elle a permis une meilleure connaissance des virus, la préparation de vaccins nouveaux ou, selon des techniques nouvelles, la découverte d’espèces virales qui étaient jusqu’alors totalement inconnues. Puis une troisième étape, qui dure encore aujourd’hui, a débuté avec l’emploi des moyens d’étude de la particule virale encore plus approfondis, et qui ont fait de la virologie une branche de la biologie moléculaire (cf. biologie MOLÉCULAIRE).

Multiplication des virus

La multiplication des virus est recherchée comme première étape lors d’une identification, ou pour obtenir de grandes quantités de virus en vue de la préparation de vaccins ou d’antigènes pour les réactions sérologiques. Dans le premier cas, un prélèvement de produit pathologique, provenant d’un organisme infecté, ne contient en général qu’un nombre de particules virales trop faible pour que leur présence puisse être reconnue; la multiplication de ces particules permettra de disposer d’un matériel utilisé ultérieurement dans les procédés d’identification et, en même temps, d’observer les modifications de l’hôte susceptibles d’orienter ou de déterminer cette identification.

L’isolement d’un virus se fait en inoculant un système cellulaire qui peut être représenté par un animal entier ou par des cellules cultivées in vitro .

Inoculation à l’animal

Le choix de l’espèce animale et celui de la voie d’introduction dépendent des affinités particulières de l’espèce virale envisagée. L’inoculum contenant (ou susceptible de contenir) un virus est injecté sous la peau ou dans le muscle, laissant à la circulation le soin de le disséminer et de le diriger vers les régions électivement réceptives, ou encore introduit directement au sein de l’organe sensible. On utilise au laboratoire une grande variété d’animaux et de voies d’inoculation dont voici quelques exemples: voie intracérébrale chez la souris ou le lapin pour le virus de la rage, poche jugale du hamster nouveau-né pour certains virus cancérigènes, virus de la vaccine inoculé par scarifications cutanées ou cornéennes chez le lapin, cavité amniotique ou allantoïdienne de l’œuf de poule embryonné pour le virus de la grippe, voie intrapéritonéale avec les virus coxsackie chez le souriceau nouveau-né. La récolte des virus se fait en prélevant l’organe le plus richement infecté (par exemple, le cerveau pour la rage) ou l’animal entier (souriceau pour le virus coxsackie, embryon de poulet pour la fièvre jaune).

L’organe ou l’animal est alors réduit en un broyat que l’on met en suspension dans une solution adéquate. Une centrifugation permet d’éliminer les fragments de tissus et on recueille le surnageant qui contient en général une quantité importante de virus. Dans le cas de l’œuf de poule embryonné inoculé avec un virus de la grippe, il suffit de prélever le ou les liquides contenus dans les cavités de l’œuf.

Cultures cellulaires

On distingue schématiquement deux types de cultures cellulaires: les cultures primaires et les cultures en lignée continue. Les premières sont obtenues à partir d’un organe entier prélevé chez un animal. Elles permettent de former une nappe de cellules que l’on utilise généralement une seule fois. Les secondes dérivent le plus souvent d’un tissu cancéreux (cancer de la bouche: cellules KB; cancer du col de l’utérus: cellule HeLa) et peuvent être reproduites indéfiniment par passages successifs in vitro . Un type particulier de cultures cellulaires est représenté par les cellules diploïdes, généralement fibroblastiques, dont le caryotype est normal, mais qui ne peuvent subir qu’un nombre limité de passages (exemple: souche WI 38 de l’institut Wistar).

Que l’on parte d’un organe (pour les cellules primaires) ou d’une culture de cellules en lignée continue, la séparation des cellules se fait par action d’un enzyme, habituellement la trypsine, et donne une suspension de cellules isolées. Après élimination de la trypsine par centrifugation ou par dilution, on remet les cellules en suspension dans un milieu nutritif qui permet leur multiplication. Réparties en flacons plats stationnaires, ou en récipients cylindriques animés d’un mouvement de rotation lent, les cellules se fixent sur la paroi de verre et donnent naissance à des cellules filles qui, en se multipliant, recouvrent la paroi d’un tapis continu, représenté par une seule couche de cellules. Les cellules primaires arrêtent là leur croissance par le phénomène de l’inhibition de contact. Pendant toute la durée de leur croissance, les cellules doivent être maintenues à une température constante, voisine de 37 ou 38 ⁰C. L’emploi de la trypsine (ou trypsination) peut être remplacé par celui du versène (acide éthylènediaminetétracétique) pour les cellules en lignée continue.

Les milieux de culture sont constitués par une solution aqueuse isotonique tamponnée de sels minéraux contenant des acides aminés, des vitamines, divers facteurs de croissance et un pourcentage variable de sérum frais de jeune animal. Ces milieux, de même que les solutions de trypsine, doivent être stériles. On y ajoute le plus souvent un indicateur coloré tel que le rouge de phénol (ou phénosulfonephtaléine) pour exercer un contrôle permanent du pH qui doit être voisin de 7. Parmi les milieux les plus couramment utilisés, on citera celui de Parker et celui d’Eagle.

On peut aussi obtenir une croissance des cellules au sein d’un milieu de culture sans que nécessairement les cellules adhèrent à la paroi du récipient. Un agitateur maintient une turbulence modérée au sein de la phase liquide et les cellules se multiplient en suspension.

Les cultures primaires les plus utilisées en virologie s’obtiennent à partir de cellules épithéliales de rein (singe, lapin, bovidés, ovins ou homme), ou de la membrane amniotique du placenta, ou enfin d’embryons d’oiseaux (poulet, canard).

Identification des virus

Symptomatologie chez l’animal

La simple notion d’infection obtenue chez une espèce animale donnée après l’inoculation avec une suspension virale inconnue apporte déjà un élément d’identification. Les signes cliniques révélateurs d’un tropisme particulier pour un organe ou un système donnent des renseignements supplémentaires, de même que l’examen histologique de coupes d’organes prélevés chez l’animal. Mais ces procédés, autrefois essentiels en virologie, sont aujourd’hui secondaires pour la plupart des virus, et remplacés par d’autres méthodes plus précises.

Effet cytopathogène

Les cellules en culture, parasitées par certains virus, ont un aspect modifié, aisément observable au microscope optique, à l’état frais ou après coloration. À travers la paroi d’un tube de culture cellulaire infectée, on peut voir les cellules se détacher progressivement du verre, prendre une forme arrondie et augmenter leur réfringence. L’emploi de cultures sur lamelle de verre permet une coloration (hématéine-éosine par exemple) et une observation au microscope à plus fort grossissement. Dans ces conditions, on peut noter la présence d’inclusions qui correspondent à une accumulation de particules virales produites au sein de la cellule. Ces inclusions peuvent être localisées dans le cytoplasme (entérovirus, myxovirus) ou dans le noyau (adénovirus, herpesvirus). Les cellules infectées forment aussi parfois des nappes cytoplasmiques contenant un nombre plus ou moins grand de noyaux, que l’on appelle des syncytiums: c’est l’effet cytopathogène obtenu à l’état pur avec le virus syncytial respiratoire, ou bien associé à des inclusions intranucléaires avec le virus de la rougeole, ou encore associé à des inclusions intracytoplasmiques avec certains myxovirus.

Les aspects microscopiques des effets cytopathogènes sont très variés; étudiés en même temps que le type de culture cellulaire qui s’est révélée réceptive à l’infection par un virus donné, ils permettent de poser un diagnostic portant sur la famille de virus en présence ou même, parfois, de poser un diagnostic d’espèce.

Identification sérologique

Aussi riches d’enseignement que puissent être les résultats de l’inoculation à l’animal et ceux de l’observation d’un effet cytopathogène, pratiquement l’identification d’un virus a toujours besoin d’être précisée ou confirmée par une réaction sérologique (cf. infra ). On notera qu’elle se pratique sous la forme «antigène inconnu-anticorps connu», c’est-à-dire que la suspension virale à identifier sera mise en présence d’un sérum spécifique, parfaitement connu pour contenir les anticorps correspondant à une espèce virale unique ou même à l’un des types d’une espèce.

Sérologie des virus

Dans leur principe, les procédés sérologiques mis en œuvre pour identifier un virus, c’est-à-dire un antigène, ou pour révéler la présence d’anticorps dans un sérum sont les mêmes que ceux que l’on utilise en bactériologie. Ils sont toujours fondés sur la formation d’un complexe antigène-anticorps homologue dont la présence éventuelle est révélée par divers procédés:

– Fixation du complément : dans un premier temps, le complément se fixe sur le complexe antigène-anticorps; dans un deuxième temps, un système composé d’hématies et d’un sérum hémolytique homologue est introduit dans la réaction, le sérum entrant en jeu si le complément a été laissé libre lors du premier temps de la réaction (cf. COMPLÉMENT, fig. 1);

– Séroneutralisation : on éprouve l’effet neutralisant d’anticorps sur un virus introduit à l’état vivant dans la réaction; pour savoir si l’immum-complexe a pu se former, on recherche la présence de virus actif en fin de réaction en inoculant le mélange virus-sérum à un animal ou à des cellules en culture;

– Inhibition de l’ hémagglutination : l’agglutination de globules rouges provoquée par un virus sera empêchée par les anticorps spécifiques de ce même virus, la réaction étant réalisée in vitro ; une variante de cette réaction est représentée par l’inhibition de l’hémadsorption, dans laquelle les virus à identifier sont encore présents dans les cellules en culture.

– Immunofluorescence : les anticorps spécifiques sont couplés à une substance fluorescente, le complexe antigène-anticorps formé étant révélé à l’examen microscopique dans un rayonnement d’une longueur d’onde particulière;

– Précipitation en milieu gélifié : l’immun-complexe formé en cas de réaction positive est objectivé par l’apparition dans le gel de une ou de plusieurs lignes de précipités visibles à l’œil nu.

Ces réactions peuvent être simplement qualitatives, si les proportions relatives des deux réactifs sont convenables, ou quantitatives, permettant le titrage des anticorps d’un sérum introduit sous forme d’une série de dilutions en progression constante. Elles sont réalisées par une macrométhode, une semi-microméthode ou une microméthode, les réactifs étant introduits sous des volumes de l’ordre du millilitre, du quart de millilitre ou du quart de dixième de millilitre.

On peut donc pratiquer une sérologie virale selon deux réactions: soit anticorps connu-antigène inconnu, pour identifier un virus, soit anticorps inconnu-antigène connu, pour révéler la présence d’anticorps spécifiques dans un sérum et évaluer leur concentration.

Diagnostic médical

Beaucoup de maladies virales ne sont pas identifiables par le seul examen clinique. La virologie permet en ce cas de poser un diagnostic au laboratoire, en mettant en œuvre essentiellement deux procédés: l’isolement et l’identification du virus, ou la sérologie.

Isolement et identification du virus

Les méthodes d’isolement et d’identification du virus ont déjà été brièvement décrites dans les paragraphes précédents. Pour les mettre en application, on part d’un prélèvement effectué chez le malade, prélèvement choisi en fonction des indications fournies par l’examen clinique. C’est ainsi qu’on partira d’un prélèvement de mucosités pharyngées pour un diagnostic virologique de grippe, d’une croûte cutanée ou du contenu d’une pustule pour le diagnostic de la variole, d’un échantillon de sang pour identifier une arbovirose, ou de selles pour diagnostiquer une poliomyélite.

La date de ce prélèvement est importante si l’on veut avoir des chances d’y déceler un virus. Les isolements ne sont en effet généralement réussis que si le prélèvement a été pratiqué au tout début de la maladie, soit, par exemple, le premier jour pour une infection à arbovirus, les deux ou trois premiers jours pour une infection à virus respiratoire, la première semaine pour une entérovirose.

La thermolabilité des virus humains et animaux, constante à peu d’exceptions près, impose la conservation et le transport du prélèvement sous réfrigération en attendant son traitement et son inoculation à l’hôte sensible.

Sérologie

L’observation de la présence d’anticorps spécifiques d’un virus dans l’échantillon de sang prélevé chez un malade ne suffit pas, dans la plupart des cas, pour affirmer que la maladie considérée est bien due à ce virus. Ces anticorps peuvent correspondre à une infection antérieure, guérie depuis longtemps ou n’ayant jamais dépassé un stade infraclinique, laissant derrière elle cette trace sérologique qui parfois persiste toute la vie. Aussi, en pratique, pour poser un diagnostic d’infection virale contemporaine et cause de la maladie considérée, il faut mettre en évidence une apparition d’anticorps ou une élévation du titre des anticorps. Pour cela, on procède au prélèvement de deux échantillons: l’un au tout début de la maladie, l’autre deux ou trois semaines plus tard. La comparaison des titres en anticorps de ces échantillons aura seule une valeur diagnostique. L’interprétation d’une telle sérologie, souvent délicate, devra tenir compte de différents facteurs, parmi lesquels le type d’anticorps considéré: ceux qui sont révélés par la fixation du complément sont précoces et éphémères; les anticorps inhibant l’hémagglutination et, surtout, les anticorps neutralisants, apparaissent tardivement mais persistent pendant très longtemps.

Applications à la préparation de vaccins

Les vaccins viraux

Comme les autres vaccins, les vaccins viraux apportent à l’organisme un matériel biologique contre lequel s’établira une immunité révélée par l’apparition d’anticorps et, surtout, par un état réfractaire à l’infection par l’agent viral considéré. Ce matériel biologique peut être un antigène viral inerte: il s’agit des vaccins dits «tués» ou «inactivés». Il peut aussi être représenté par un virus actif, susceptible de se multiplier dans l’organisme qui le reçoit, mais incapable de provoquer une maladie cliniquement décelable: ce sont les vaccins «vivants atténués».

Dans les deux cas, le matériel de départ peut être fourni par un animal entier, par l’œuf embryonné ou par des cultures cellulaires, ces dernières étant de plus en plus largement utilisées. L’inoculation de ces tissus sensibles se fait toujours en partant d’une suspension virale unique, répartie en récipients multiples, appelée «lot de semence». Chaque lot de vaccin est préparé à partir de l’une des fractions de ce lot de semence dont les qualités de pureté et d’efficacité ont été intensivement établies.

Les vaccins inactivés se préparent généralement à partir d’une souche de virus ayant conservé ses caractères pathogènes. L’inactivation doit faire disparaître la capacité du virus de se multiplier, tout en conservant ses propriétés antigéniques; elle met en œuvre des procédés physiques (chaleur, rayonnement ultraviolet) ou chimiques (formol, acide phénique, 廓 propiolactone).

Les souches virales que contiennent les vaccins vivants ont été sélectionnées par des procédés variés tels que des «passages» répétés chez l’animal ou en cultures cellulaires, des cultures à basse température. De tels vaccins doivent contenir une quantité exactement définie de particules virales actives. Ils sont généralement plus efficaces que les vaccins inactivés, mais leur emploi chez l’homme doit être précédé d’une expérimentation au laboratoire, longue et complexe, afin de s’assurer de leur innocuité comme de leur efficacité.

Purification et conservation

Quel que soit le procédé de préparation, le matériel viral récolté contient toujours, en plus de l’antigène actif, des substances organiques provenant des tissus ayant servi à la multiplication des virus. Ces substances sont inutiles et souvent nocives par les réactions qu’elles peuvent provoquer chez les sujets vaccinés. De plus en plus, on s’efforce d’éliminer le matériel inactif pour ne conserver que les particules virales. La connaissance des propriétés physico-chimiques respectives des virus et des impuretés est à la base de différents procédés de purification tels que la filtration, le centrifugation différentielle, la centrifugation zonale en gradient de densité, la chromatographie, le traitement par des solutions ou des substances chimiques adaptées. On peut même pousser plus loin la purification en dissociant la particule virale elle-même et en ne conservant que ses composants porteurs de l’activité antigénique immunisante. On obtient alors des vaccins inactivés dont la préparation, longue et délicate, pose encore des problèmes de rendement et n’aboutit pas toujours à un produit pleinement efficace.

La plupart des vaccins inactivés et, surtout, des vaccins vivants sont des produits instables, détruits plus ou moins rapidement par la chaleur. Pour conserver leurs propriétés immunisantes et rendre moins importante l’obligation astreignante du stockage et du transport à basse température, on soumet ces vaccins à une dessiccation sous vide à l’état congelé. La forme lyophilisée obtenue est souvent très résistante à la chaleur et permet une conservation de longue durée.

Contrôles

Tout au long des différentes étapes de la production d’un vaccin et au niveau du produit final, on procède à des contrôles très rigoureux et en nombre considérable, tendant à s’assurer de la pureté, de l’innocuité et de l’efficacité de la préparation. La présence d’agents contaminants est ainsi recherchée: agents bactériens, fongiques ou viraux, ces derniers risquant d’être apportés par les tissus ayant servi à la multiplication des virus. L’efficacité est mesurée par une épreuve d’antigénicité, en comparaison avec une préparation de référence soigneusement étalonnée. Tous ces contrôles sont définis par une réglementation nationale, en accord avec des recommandations émises par l’Organisation mondiale de la santé.

Méthodes d’études physiques

La filtration sur des membranes dont la porosité est calibrée avec une grande précision permet de connaître avec une assez bonne approximation la taille des particules virales selon qu’elles traversent ou non ces membranes.

En suspension dans un milieu homogène ou dans une solution de concentration croissante (gradient de saccharose, de chlorure de césium), les particules virales, soumises à une force centrifuge plus ou moins élevée, migrent ou se stabilisent en fonction de leurs propriétés physiques dont quelques détails sont ainsi révélés.

Si l’examen microscopique ordinaire (ou photonique) peut permettre l’observation des amas de virions représentés par les inclusions cellulaires, on a recours à la microscopie électronique, dont le pouvoir de résolution est incomparablement plus élevé, pour connaître la structure, la forme et les dimensions des particules virales.

• 1945; de viro- « virus » et -logie

n. f. Didac. Partie de la biologie qui étudie les virus.

⇒VIROLOGIE, subst. fém.

BIOL. Partie de la biologie qui étudie les virus. La virologie est actuellement en plein développement. Son histoire a eu pour prologue la découverte de Jenner. Elle a véritablement débuté avec les travaux de Pasteur sur la rage (BARIÉTY, COURY, Hist. méd., 1963, p. 724).

REM. 1. Virologique, adj., biol. Relatif à la virologie. Les animaux [de laboratoire] sont soumis à des vérifications constantes (...) et notamment à des contrôles virologiques, bactériologiques, histologiques et biochimiques (Le Figaro, 20 sept. 1966 ds GILB. 1971). 2. Virologiste, virologue, subst., biol. Spécialiste de virologie. Il est (...) naturel que l'étude des éléments nucléo-protéiques cellulaires normaux ait puissamment sollicité les virologues (P. MORAND, Confins vie, 1955, p. 101). Forme virologiste ds Méd. Biol. t. 3 1972.

Prononc.:[]. Étymol. et Hist. [1945 (s. réf. ds ROB. Suppl. 1970)] 1951 (C.r. de l'Ac. des sc., t. 233, p. 1704). Comp. des élém. formants viro-, tiré de virus et -logie. Cf. angl. virology (1935 ds NED Suppl.²).

virologie [viʀɔlɔʒi] n. f.

ÉTYM. 1945; du rad. de virus, et -logie.

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♦ Biol. Étude des virus. || Application de la culture de tissus à la bactériologie et à la virologie.

Jean Verne et Simone Hébert, la Culture de tissus, p. 99.

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